Sitokrom P-4501A1 (CYP1A1) gen diatur oleh beberapa faktor trans-acting termasuk 4 S polycyclic aromatik hidrokarbon (PAH)-binding protein, yang baru-baru ini diidentifikasi sebagai N-methyltransferase glisin (GNMT) (Raha, A., Wagner, C., Macdonald, R. G., dan Bresnick, E. (1994) J. Biol. Chem. 269, 5750 -- 5756). Peran GNMT sebagai 4 S PAH-mengikat protein menengahi induksi sitokrom P-4501A1 telah diselidiki lebih lanjut. GNMT cDNA, yang kloning ke dalam vektor pMAMneo berisi Rous sarcoma virus promotor dan gen resistensi neomisin, adalah secara stabil transfected ke indung telur hamster Cina D422 (CHO) sel. Beberapa klon positif dipilih oleh reverse transcription-polymerase chain reaction dan diuji untuk ekspresi protein rekombinan. Barat noda analisis menunjukkan ekspresi signifikan tingkat dari 4 S protein dalam transfected CHO secara stabil sel (CHO-GNMT).
Polycyclic aromatic hydrocarbon seperti B [a] P1, 3 methylcholanthrene, dan TCDD adalah polusi lingkungan yang mendatangkan berbagai beracun, teratogenic, dan karsinogenik tanggapan di terekspos hewan (1-7). Selain itu, bahan ini inducers ampuh reaksi tertentu yang biotransformation dikatalisis oleh sitokrom P-450-bergantung monooxygenases, keluarga super yang terdiri dari lebih isozymic hemoproteins dari 12 kelompok gen (8). Isozymes ini layar lebar substrat kekhususan dan memetabolisme substrat endogen baik dan xenobiotics untuk elektrofilik derivatif, beberapa di antaranya dapat berinteraksi dengan DNA, sehingga berpotensi mengaktifkan protooncogenes atau menonaktifkan gen supresor tumor.
Parsial sequencing dari 33-kDa protein 4 S menunjukkan identitasnya sebagai GNMT (S-adenosylmethionine: glisin N-methyltransferase, EC 2.1.1.20). Berdasarkan sejumlah kriteria, GNMT dan 4 S PAH-binding protein yang ditampilkan untuk menjadi satu dan protein yang sama (34).
Kami menyimpulkan GNMT yang terlibat dalam aktivasi transkripsional dari CYP1A1, sehingga memberikan alternatif, Ah reseptor-independen jalur untuk modulasi ekspresi CYP1A1 oleh tertentu PAHs, seperti B [a] P, B [e] P, dan 3-methylcholanthrene.
Bahan Dan Metode
Kimia-medium kultur jaringan, yang-minimal medium penting, serum janin sapi, gentamycin, geneticin (G418), dan Lipofectin itu dibeli dari Life Technologies, Inc sumber bahan lain adalah: [a-32P] dATP dari ICN biokimia (Irvine, CA); [3H] B [a] P
(60 Ci / mmol) dari Amersham Corp; [3H] TCDD (41 Ci / mmol) dari Chem-Syn Science Labs (Lenexa, KS); Immobilon P dari Millipore (Bedford, MA); S & S mentransfer membran dari Schleicher & Schuell (Keene, NH); BM Chemiluminescence blotting Barat kit dari Biochemica Boehringer Mannheim Corp (Indianapolis, IN); Tris, TEMED,Tween 20, B [a] P, B [e] P, 3-methylcholanthrene, TCDD, Isositrat dehidrogenase, nikotinamida, ethoxyresorufin, dan resorufin dari Sigma. Afinitas-dimurnikan antibodi terhadap Ah GNMT dan reseptor itu murah hati hadiah dari Dr Conrad Wagner (Vanderbilt University) dan Dr Bill Greenlee (University of Massachusetts Medical Center), masing-masing. Ah reseptor yang mengandung plasmid cDNA itu baik disediakan oleh Dr Chris Bradfield (University of Wisconsin). Mouse garis sel hepatoma, HEPA-1, yang digunakan sebagai kontrol positif dalam mengikat XRE percobaan.
Plasmid konstruksi dan transfection-The GNMT cDNA ini disintesis dengan RT-PCR metodologi dari hati tikus poli (A) 1 RNA persiapan.GNMT spesifik yang maju dan reverse primer adalah 59-GAGCCAGCTAGCGTCAGGATGGTGGACdan 59-TGGGAGCTCGAGCCAGGCTCAGCCTGT, masing-masing. Produk berikutnya dimurnikan dengan gel agarosa electophoresis, dan urutan ini ditunjukkan identik dengan diterbitkan GNMT cDNA (43). Dua situs kloning untuk NheI dan XhoI dimasukkan ke dalam daerah noncoding dari GNMT cDNA oleh metodologi PCR. Yang disucikan DNA beruntai ganda Produk ini diligasi ke NheI / XhoI-dicerna pMAMneo (CLONTECH, Palo Alto, CA). Plasmid membangun, pMAMneo / GNMT, berisi yang GNMT masukkan dari ukuran yang sesuai dalam arti orientasi sebagai ditentukan oleh urutan pembatasan pencernaan dan tekad. pMAMneo / GNMT adalah transfected ke sel CHO oleh Lipofectin metode. Singkat, pada hari 0, 10 mg DNA dalam 100 ml Opti-MEM aku dicampur dengan 15 ml Lipofectin reagen, dilapisi ke sekitar 2 3 105 sel dalam 2 ml serum pertumbuhan bebas menengah, dan diinkubasi selama 24 jam pada 37 ° C dalam inkubator CO2. DNS transfectants didirikan menggunakan DNA dari plasmid pMAMneo orangtua. Pada hari 1, DNAcontaining menengah digantikan oleh standar serum-termasuk pertumbuhan menengah, dan inkubasi dilanjutkan untuk tambahan 48 h. Pada hari 4, sel-sel ditempatkan dalam medium yang mengandung pilihan geneticin (0,4 mg / ml). Klon sel tunggal yang dipetik, ditanam di medium seleksi, dan diuji untuk GNMT ekspresi melalui Western blotting dan B [a] P Aktivitas mengikat. SDS-Polyacrylamide Gel Elektroforesis dan Western blotting-The transfected secara stabil klon sudah dewasa dalam medium minimal esensial mengandung 0,4 mg / ml G418, 10% dialyzed serum janin sapi, dan 1 mM deksametason.
Hasil
Kurangnya aktivitas reseptor Ah dikonfirmasi oleh fungsional assay nuklir melibatkan XRE translokasi dan mengikat eksperimen dengan GNMT CHO-sel; HEPA-1 tikus hepatoma sel digunakan sebagai kontrol positif (Gambar 6). Pembentukan dari XRE-Ah reseptor kompleks ditunjukkan dengan ekstrak dari cytosolic HEPA-1 sel yang telah diperlakukan in vitro dengan TCDD (jalur 2). Tidak kompleks seperti demonstrasi -
FIG. 3. Analisis gradien densitas sukrosa B [a] p (A) dan TCDD (B) cytosolic CHO mengikat dengan protein. The cytosolic protein (0,5-1 mg) telah diinkubasi dengan [3H] B [a] P (A) atau [3H] TCDD (B) untuk 60 menit pada 4 ° C dan selama 2 jam pada suhu kamar, masing-masing
Pembentukan reseptor XRE-Ah rumit juga dibuktikan dengan ekstrak nuklir dibuat dari HEPA-1 sel yang telah diperlakukan in vivo dengan TCDD (jalur 4). Sekali lagi, tidak kompleks seperti diamati dengan diobati TCDD-CHO-GNMT ekstrak nuklir (jalur 8).
Sel CHO-kurangnya GNMT setiap endogen Ah ekspresi reseptor dan bahwa PAH-induced ekspresi CYP1A1 terjadi melalui sebuah Ah receptorin dependent jalur.
Diskusi
Hasil sekarang menunjukkan bahwa pameran GNMT fungsi beragam, salah satunya sebagai sebuah enzim dan yang lain sebagai penggerak transkripsional. Aspek ekonomi molekuler tidak unik untuk GNMT tetapi dipakai oleh beberapa protein lain yang berfungsi sebagai enzim dan aktivator. Beberapa enzim dalam jalur glikolitik telah terbukti menjadi pengikat DNA protein (63). Sebagai contoh, 37-kDa subunit gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase juga melayani dalam perbaikan DNA sama sekali tidak terkait berfungsi sebagai DNA urasil glycosylase (64). Salah satu dari dua pengakuan primer protein yang merangsang aktivitas DNA polimerase-α dalam replikasi telah diidentifikasi sebagai 3-phosphoglycerate kinase (42).
Sebagai kesimpulan kami telah menunjukkan bahwa GNMT adalah PAH-binding protein yang menjadi perantara induksi CYP1A1 oleh Ah reseptor-jalur independen. Penyelidikan tambahan diperlukan untuk lebih memahami faktor-faktor yang mengatur.
GNMT jumlah dan karena itu dimerik mengendalikan ekspresi dari CYP1A1.
Polycyclic aromatic hydrocarbon seperti B [a] P1, 3 methylcholanthrene, dan TCDD adalah polusi lingkungan yang mendatangkan berbagai beracun, teratogenic, dan karsinogenik tanggapan di terekspos hewan (1-7). Selain itu, bahan ini inducers ampuh reaksi tertentu yang biotransformation dikatalisis oleh sitokrom P-450-bergantung monooxygenases, keluarga super yang terdiri dari lebih isozymic hemoproteins dari 12 kelompok gen (8). Isozymes ini layar lebar substrat kekhususan dan memetabolisme substrat endogen baik dan xenobiotics untuk elektrofilik derivatif, beberapa di antaranya dapat berinteraksi dengan DNA, sehingga berpotensi mengaktifkan protooncogenes atau menonaktifkan gen supresor tumor.
Parsial sequencing dari 33-kDa protein 4 S menunjukkan identitasnya sebagai GNMT (S-adenosylmethionine: glisin N-methyltransferase, EC 2.1.1.20). Berdasarkan sejumlah kriteria, GNMT dan 4 S PAH-binding protein yang ditampilkan untuk menjadi satu dan protein yang sama (34).
Kami menyimpulkan GNMT yang terlibat dalam aktivasi transkripsional dari CYP1A1, sehingga memberikan alternatif, Ah reseptor-independen jalur untuk modulasi ekspresi CYP1A1 oleh tertentu PAHs, seperti B [a] P, B [e] P, dan 3-methylcholanthrene.
Bahan Dan Metode
Kimia-medium kultur jaringan, yang-minimal medium penting, serum janin sapi, gentamycin, geneticin (G418), dan Lipofectin itu dibeli dari Life Technologies, Inc sumber bahan lain adalah: [a-32P] dATP dari ICN biokimia (Irvine, CA); [3H] B [a] P
(60 Ci / mmol) dari Amersham Corp; [3H] TCDD (41 Ci / mmol) dari Chem-Syn Science Labs (Lenexa, KS); Immobilon P dari Millipore (Bedford, MA); S & S mentransfer membran dari Schleicher & Schuell (Keene, NH); BM Chemiluminescence blotting Barat kit dari Biochemica Boehringer Mannheim Corp (Indianapolis, IN); Tris, TEMED,Tween 20, B [a] P, B [e] P, 3-methylcholanthrene, TCDD, Isositrat dehidrogenase, nikotinamida, ethoxyresorufin, dan resorufin dari Sigma. Afinitas-dimurnikan antibodi terhadap Ah GNMT dan reseptor itu murah hati hadiah dari Dr Conrad Wagner (Vanderbilt University) dan Dr Bill Greenlee (University of Massachusetts Medical Center), masing-masing. Ah reseptor yang mengandung plasmid cDNA itu baik disediakan oleh Dr Chris Bradfield (University of Wisconsin). Mouse garis sel hepatoma, HEPA-1, yang digunakan sebagai kontrol positif dalam mengikat XRE percobaan.
Plasmid konstruksi dan transfection-The GNMT cDNA ini disintesis dengan RT-PCR metodologi dari hati tikus poli (A) 1 RNA persiapan.GNMT spesifik yang maju dan reverse primer adalah 59-GAGCCAGCTAGCGTCAGGATGGTGGACdan 59-TGGGAGCTCGAGCCAGGCTCAGCCTGT, masing-masing. Produk berikutnya dimurnikan dengan gel agarosa electophoresis, dan urutan ini ditunjukkan identik dengan diterbitkan GNMT cDNA (43). Dua situs kloning untuk NheI dan XhoI dimasukkan ke dalam daerah noncoding dari GNMT cDNA oleh metodologi PCR. Yang disucikan DNA beruntai ganda Produk ini diligasi ke NheI / XhoI-dicerna pMAMneo (CLONTECH, Palo Alto, CA). Plasmid membangun, pMAMneo / GNMT, berisi yang GNMT masukkan dari ukuran yang sesuai dalam arti orientasi sebagai ditentukan oleh urutan pembatasan pencernaan dan tekad. pMAMneo / GNMT adalah transfected ke sel CHO oleh Lipofectin metode. Singkat, pada hari 0, 10 mg DNA dalam 100 ml Opti-MEM aku dicampur dengan 15 ml Lipofectin reagen, dilapisi ke sekitar 2 3 105 sel dalam 2 ml serum pertumbuhan bebas menengah, dan diinkubasi selama 24 jam pada 37 ° C dalam inkubator CO2. DNS transfectants didirikan menggunakan DNA dari plasmid pMAMneo orangtua. Pada hari 1, DNAcontaining menengah digantikan oleh standar serum-termasuk pertumbuhan menengah, dan inkubasi dilanjutkan untuk tambahan 48 h. Pada hari 4, sel-sel ditempatkan dalam medium yang mengandung pilihan geneticin (0,4 mg / ml). Klon sel tunggal yang dipetik, ditanam di medium seleksi, dan diuji untuk GNMT ekspresi melalui Western blotting dan B [a] P Aktivitas mengikat. SDS-Polyacrylamide Gel Elektroforesis dan Western blotting-The transfected secara stabil klon sudah dewasa dalam medium minimal esensial mengandung 0,4 mg / ml G418, 10% dialyzed serum janin sapi, dan 1 mM deksametason.
Hasil
Kurangnya aktivitas reseptor Ah dikonfirmasi oleh fungsional assay nuklir melibatkan XRE translokasi dan mengikat eksperimen dengan GNMT CHO-sel; HEPA-1 tikus hepatoma sel digunakan sebagai kontrol positif (Gambar 6). Pembentukan dari XRE-Ah reseptor kompleks ditunjukkan dengan ekstrak dari cytosolic HEPA-1 sel yang telah diperlakukan in vitro dengan TCDD (jalur 2). Tidak kompleks seperti demonstrasi -
FIG. 3. Analisis gradien densitas sukrosa B [a] p (A) dan TCDD (B) cytosolic CHO mengikat dengan protein. The cytosolic protein (0,5-1 mg) telah diinkubasi dengan [3H] B [a] P (A) atau [3H] TCDD (B) untuk 60 menit pada 4 ° C dan selama 2 jam pada suhu kamar, masing-masing
Pembentukan reseptor XRE-Ah rumit juga dibuktikan dengan ekstrak nuklir dibuat dari HEPA-1 sel yang telah diperlakukan in vivo dengan TCDD (jalur 4). Sekali lagi, tidak kompleks seperti diamati dengan diobati TCDD-CHO-GNMT ekstrak nuklir (jalur 8).
Sel CHO-kurangnya GNMT setiap endogen Ah ekspresi reseptor dan bahwa PAH-induced ekspresi CYP1A1 terjadi melalui sebuah Ah receptorin dependent jalur.
Diskusi
Hasil sekarang menunjukkan bahwa pameran GNMT fungsi beragam, salah satunya sebagai sebuah enzim dan yang lain sebagai penggerak transkripsional. Aspek ekonomi molekuler tidak unik untuk GNMT tetapi dipakai oleh beberapa protein lain yang berfungsi sebagai enzim dan aktivator. Beberapa enzim dalam jalur glikolitik telah terbukti menjadi pengikat DNA protein (63). Sebagai contoh, 37-kDa subunit gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase juga melayani dalam perbaikan DNA sama sekali tidak terkait berfungsi sebagai DNA urasil glycosylase (64). Salah satu dari dua pengakuan primer protein yang merangsang aktivitas DNA polimerase-α dalam replikasi telah diidentifikasi sebagai 3-phosphoglycerate kinase (42).
Sebagai kesimpulan kami telah menunjukkan bahwa GNMT adalah PAH-binding protein yang menjadi perantara induksi CYP1A1 oleh Ah reseptor-jalur independen. Penyelidikan tambahan diperlukan untuk lebih memahami faktor-faktor yang mengatur.
GNMT jumlah dan karena itu dimerik mengendalikan ekspresi dari CYP1A1.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar